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3. DISKUSSION 97

Letztendlich konnte bei der Kultivierung in günstigem, synthetischem Medium eine wesent-

lich höhere Ausbeute an aktiver ROL erreicht werden, als im kostenintensiveren komplexen

Medium. Die Expression der ROL in Pichia pastoris erbrachte eine wesentlich bessere Aus-

beute an aktiver Lipase als in Escherichia coli und benötigt außerdem wesentlich weniger

Reinigungsschritte. Diese Vorteile wiegen eindeutig den höheren Aufwand an Zeit auf, den

man bei der Hefe gegenüber der Bakterienkultivierung hat.

3.4 Vergleich der Eigenschaften von ROL und ProROL produziert in

Rhizopus oryzae, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae und

Pichia pastoris

Bei der intrazellulären Expression von ROL in E. coli ist durch die Bildung von inaktiven

Inclusion Bodies, eine Renaturierungs-Prozedur nötig. Diese wird durch den Umstand er-

schwert, daß drei Cystein-Brücken richtig geknüpft werden müssen, um ein aktives Protein zu

erhalten. Es ist also während der Faltung nötig die falsch geknüpften Schwefelbrücken erst

reduktiv zu spalten um sie dann oxidativ wieder zu knüpfen. Bei der Expression in Hefe ge-

lang es Takahashi et al. ein Gemisch aus ProROL und Pro(28)ROL in Saccharomyces

cerevisiae zu exprimieren und in das Medium zu sekretieren (Takahashi, et al. 1998). Diese

Mischung ist jedoch in ihren Eigenschaften nicht mit der nativen ROL identisch und muß

deshalb als eigenständiges Enzym betrachtet werden (siehe unten).

In dieser Arbeit wurde die Expression der reifen ROL in Saccharomyces cerevisiae unter

Kontrolle des GAL1 Promotors untersucht. Es konnte jedoch nur eine schwache Lipase-

aktivität im Überstand detektiert werden, die für weitergehende Untersuchungen viel zu ge-

ring war.

Durch die Verwendung von Pichia pastoris als Expressionssystem konnte in dieser Arbeit die

aktive, reife Lipase aus Rhizopus oryzae in das Medium sekretiert werden mit einer Ausbeute

von 156 mg l

-1

aktiver Lipase (gereinigt 68 mg l

-1

), die sogar um ein vielfaches höher ist wie

die bei der Expression in E. coli (10-15 mg l

-1

aktive, gereinigte Lipase; siehe Tabelle 3.2).

Das Ziel, die Expression der Lipase in größerem Maßstab zu ermöglichen konnte also erreicht

werden, da der Maßstab nur noch vom Fermentervolumen bestimmt wird.

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