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3. DISKUSSION 103

Sepharose eingingen, sich aber hinsichtlich der Bindungseigenschaften bzw. des Elutions-

verhalten wie gewünscht unterschieden.

Die Entwicklung des Assays ist der entscheidende Schritt zur Durchmusterung von großen

Peptidbibliotheken. Er sollte sowohl möglichst einfach und schnell, als auch hochspezifisch

sein - um die Anzahl falschpositiver Varianten gering zu halten - und unter Bedingungen

stattfinden, die zur tatsächlichen Anwendung so weit wie möglich identisch sind.

Im vorliegenden Fall wurden diese Bedingungen durch die Verwendung von EGFP als

Reporterprotein erreicht. Mit diesem war die einfache visuelle bzw. fluoreszenzspektroskopi-

sche Detektion des Reinigungsverhaltens möglich. Weiterhin wurden Membranfilterplatten

mit 96 Kavitäten zur Nachbildung von kleinen IMAC Säulen verwendet, dies erlaubte das

parallele robotergestützte Screening von 96 Klonen. So konnte ein wesentlich höherer

Durchsatz verglichen mit den zu diesem Zweck häufig verwendeten Ni-NTA Säulen (Qiagen)

erreicht werden.

Das Screening von einer vergleichsweise geringen Anzahl von Klonen (ungefähr 1000) er-

laubte die Auffindung eines gegenüber dem HisTag verbesserten Tags (HeliTag M13).

Der Begriff verbesserter Metallbindungstag macht eine kurze Erläuterung der gewünschten

Eigenschaften eines Tags notwendig. Ein Metallaffinitätstag ist dann gegenüber dem HisTag

eine Verbesserung wenn er:

1. Selektiver bindet.

2. In einem geringerem Volumen selektiv eluiert werden kann.

3. Bei geringeren Imidazolkonzentrationen, d. h. schonender eluiert werden kann, ohne daß

die Selektivität darunter leidet.

4. Höhere Ausbeuten an gereinigtem Protein ergibt.

Auch wenn der HisTag im Moment am häufigsten verwendet wird, gibt es einige Argumente,

die gegen ihn sprechen. Zum Einen ist sein industrieller Einsatz durch Patente eingeschränkt,

zum Anderen verändert er durch seine "unnatürliche" Aminosäuresequenz häufig die Protein-

eigenschaften.

Wie Tabelle 2.7 zeigt, ist der HeliTag M13 in dieser Beziehung dem HisTag in zwei Punkten

überlegen, er eluiert in einem geringeren Volumen und erlaubt eine höhere Ausbeute. Aller-

dings ist die zur Elution benötigte Imidazol-Konzentration höher. Gegenüber dem WtHeliTag

kann er mit einer geringeren Imidazolmenge, d. h. schonender eluiert werden, ohne etwas von

seiner Selektivität einzubüßen. Gegenüber dem HisTag ist der HeliTag M13, wie auch der

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