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2. ERGEBNISSE 69

zur Elution eingesetzt. Der Einsatz von Natriumcholat (1% (w/v)) als Elutionsmittel

resultierte in einigen Fraktionen, die im UV-Bereich Absorption zeigten, jedoch keine

Lipaseaktivität (pNPP und pH Stat) zeigten. Die nachfolgende Elution mit Triton X-100 ließ

sich durch die Eigenabsorption der in diesem Detergenz enthaltenen Phenylringe nicht mehr

mit dem UV/VIS-Detektor verfolgen. Der Aktivitätsnachweis mit dem pNPP-Schnelltest war

jedoch ebenfalls für alle Fraktionen negativ. Die Analyse des SDS Gels (nicht gezeigt) ergab,

daß in einigen Fraktionen der Triton X-100-Elution ROL enthalten war, diese jedoch keine

Aktivität mehr aufwies.

Es wurde dann ein schwächeres HIC-Material, Butylsepharose, verwendet. Auch hier ergab

die Untersuchung aller Fraktionen keinerlei Aktivität.

2.3.3 Charakterisierung der ROL aus Pichia pastoris und Vergleich mit der ROL aus

E. coli

2.3.3.1 Allgemeine Charakterisierung

Zur Charakterisierung der Lipase wurden ausschließlich gereinigte Fraktionen aus Kultivie-

rungen im Schüttelkolben verwendet. Die Eigenschaften der rekombinanten ROL aus Pichia

pastoris wurde mit denen aus Escherichia coli verglichen.

Die ROL aus E. coli wurde nach der Methode von Beer et al. (Beer 1994, Beer, et al. 1998)

hergestellt. Nach Renaturierung und Aufreinigung konnten 5-7 mg ROL mit einer spezifi-

schen Aktivität von 8300 U mg

-1

, pH Stat, Triolein, 30 °C, pH 8,1 erhalten werden.

Die Analyse der SDS-PAGE (Abbildung 2.16) ergab sowohl für die ROL aus Pichia pastoris

(Spur 5), wie für die aus Escherichia coli (Spur 4) eine einzelne Bande bei ca 30 kDa. Die

ROL aus E. coli ist minimal leichter als die aus Pichia pastoris, da bei der Klonierung der

ROL zwei Aminosäuren am N-Terminus hinzugekommen waren (siehe Kapitel 2.1.1).

Obwohl in der Aminosäuresequenz der ROL drei mögliche N-Glykosylierungsstellen mit der

Aminosäuresequenz Asn-X-Ser/Thr (Kornfeld und Kornfeld 1985) vorliegen, konnte durch

die Behandlung der Lipase mit endo-β-Acetylglycosamidase (Endo H), ein Enzym, daß N-

verknüpfte Zuckerreste vom Protein abspaltet, kein Masseverlust detektiert werden

(Abbildung 2.16, Spur 2). Dies ist ein Hinweis darauf, daß an der Außenseite des Proteins

keine Zuckerreste vorkommen. Um zu ermitteln, ob die ROL an einer für Endo H unzugäng-

lichen Stelle glykosyliert ist, wurde dasselbe Experiment mit dem denaturierten Enzym

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