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5. MATERIAL & METHODEN 116

5.5.2.7 Bestimmung des Phänotyps von mit pPICZαA_ROL transformierten Pichia

pastoris

Jeweils zwei identische 200 ml Kolben befüllt mit 50 ml Basal Salz bzw. 50 ml Basal Salz

Medium ohne Glycerin jedoch mit 0,5 % (v/v) Methanol wurden mit 500 µl einer Übernacht-

kultur der verschiedenen Klone angeimpft und 24 h bei 30 °C kultiviert. Die OD

600

der

Kulturen wurde bestimmt und miteinander verglichen. Unterschied sich die OD

600

der

Kulturen um mehr als 50 % wurden sie als Mut

eingestuft.

5.5.2.8 Detektion von Methanol in synthetischem Medium durch GC

Die Methanolkonzentration wurde mit einem Gaschromatographen 5890 von Hewlett Packard

mit automatischem Injektor 7376A von Hewlett Packard durchgeführt. Die Detektion erfolgte

durch einen Flammenionisationsdetektor und das GC wurde durch die Software Millenium 32

gesteuert.

Als stationäre Phase diente eine TR-FFAP Säule (25 m X 0,53 mm) mit Helium als mobiler

Phase (9,0 ml min

-1

). Die Proben aus dem Fermenter wurden zentrifugiert und durch ein

0,45 µm Filter filtriert und ohne weitere Probenvorbereitung in das GC injiziert (1 µl; Split

1:5,5).

Die gesamte Analyse mit Ausheizphase dauerte 15 Minuten mit folgendem Programm:

• Injektor-Temperatur: 200 °C

• Detektor-Temperatur: 280 °C

• Laufbedingungen:

Start: 40 °C für 4 Min.

Gradient 1: 26,7 °C min

-1

bis 200 °C (für 7 Min)

5.5.2.9 Transformation von Pichia pastoris durch Elektroporation nach Invitrogen

5 ml einer P. pastoris Übernacht-Kultur wurden in 50 ml YPD-Medium über Nacht bei 30 °C

kultiviert. Aus dieser wurde eine 500 ml Kultur in einem 2000 ml Kolben mit 500 µl ange-

impft. Nach erneuter Inkubation über Nacht wurden die Zellen bei einer OD

600

von 1,3-1,5

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