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2. ERGEBNISSE 48

2.1.3 Transformation und Expression der ROL in Pichia pastoris X-33

In dem in Kapitel 2.1.2 verwendeten Pichia Stamm GS 115 wurde als Selektionsmarker das

his 4 Gen deletiert. Daher muß man, wenn man synthetische Medien verwenden möchte,

Histidin zusetzen. Da ein Ziel der Arbeit die Kultivierung von Pichia pastoris in syntheti-

schem Medium war, wurde der Vektor pPICZαA_ROL in den Wildtyp-Stamm X-33 trans-

formiert. Hierzu wurden verschieden Transformationsmethoden getestet (siehe auch 2.1.4).

Die Selektion verschiedener Klone erfolgte auf dieselbe Weise, wie in Kapitel 2.1.2 beschrie-

ben. Wieder wurde eine Reihe verschiedener Klone selektiert. Die Expressionsversuche zeig-

ten, daß der Klon pPICZαA_ROL 3-3 die beste Expressionsleistung mit 120 U ml

-1

bezogen

auf eine OD

600

von 15 erreichte (vgl. Kapitel 2.1.2.1 und 2.1.2.3). Folglich wurde dieser Klon

bei den weiterführenden Kultivierungen im Fermenter verwendet.

2.1.4 Vergleich verschiedener Transformationsmethoden zur Transformation von

pPICZαA_ROL in Pichia pastoris X-33

Da die Transformation von Pichia pastoris X-33 durch Elektroporation nach dem Invitrogen

Protokoll nur mit einer geringen Anzahl positiver Transformanten durchgeführt werden

konnte, wurden verschiedene Transformationsmethoden hinsichtlich ihrer Effizienz, dem

experimentellen Aufwand und der Eignung zur Lagerung kompetenter Zellen untersucht.

Die Elektroporation nach dem Invitrogen Protokoll zeigte eine geringe Effizienz mit 5-10

Transformanten pro Ansatz und vor allem die Kultivierung bis zu einer OD

600

von genau 1,3

warf häufig praktische Probleme auf. So mußten immer mehrere Kulturen angesetzt werden

um sicher zu stellen, daß zumindest eine davon die richtige OD

600

zur Transformation zu

einem bestimmten Zeitpunkt hatte. Mit dieser Methode ist es nicht möglich, kompetente Zel-

len einzufrieren und wieder zu verwenden.

Bei der Transformation mit der LiCl Methode nach einer Variante des

Transformationsprotokolls für Saccharomyces cerevisiae (Gietz, et al. 1995) wurden die

Zellen durch die Behandlung mit einer hohen Konzentration LiCl in Gegenwart von PEG zum

Schutz der Zellen, kompetent gemacht und durch Hitzeschock transformiert. Die OD

600

ist bei

dieser Methode kein so entscheidender Faktor, wie bei der nach Invitrogen, jedoch ist auch

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