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5. MATERIAL & METHODEN 132

weils mit linearen Gradienten zuerst mit dH

O, dann mit Natriumcholat in Wasser (1%

(w/v),gefolgt von Triton X-100 (1% (w/v) + 2 % (w/v)).

5.9 Bestimmung der Bindungseigenschaften von Peptidsequenzen aus

der Zufallsmutagenese

Mit EGFP transformierte Klone, die auf der Agarplatte unter UV-Licht fluoreszierten, wurden

in Mikrotiterplatten gepickt und über Nacht kultiviert. Die angewachsenen Kulturen wurden

auf eine zweite Platte überimpft, die nach 16 h Inkubation bei 37 °C als sogenannte

Masterplate bei –80 °C eingefroren wurden. Die Kulturen wurden durch mehrmaliges Ein-

frieren und Auftauen in der Mikrotiterplatte aufgeschlossen und die Mikrotiterplatten zentri-

fugiert. Der fluoreszierende klare Überstand wurde abgenommen und auf die Mikrotiter-

platten-IMAC-Säulen überführt.

Diese wurden wie folgt hergestellt:

In Membranfilter-Mikrotiterplatten (Multiscreen 5 µm; Millipore) wurde dreimal eine ge-

rührte Chelating Sepharose Emulsion (Pharmacia, Freiburg) eingefüllt und anschließend

zentrifugiert (Eppendorf-Zentrifuge 5810 R, Rotor A4-62, 350 U min

-1

, 2 Min.). Dadurch

entstanden jeweils 5 mm hohe Mini-Säulen in jeder Kavität der Mikrotiterplatte. Alle folgen-

den Schritte wurden mit dem Beckmann 2000 Roboter ausgeführt und nach jedem Schritt

wurde die Platte zentrifugiert (Eppendorf-Zentrifuge 5810 R, Rotor A4-62, 350 U min

-1

2 Min.). Die Minisäulen wurden mit 250 µl dH

O gewaschen und anschließend mit 250 µl

Metallsalz-Lösung beschickt. Die Säulen wurden dreimal mit 200 µl IMAC-Puffer (50 mM

Natriumphosphatpuffer, pH 7 mit 250 mM NaCl) gewaschen und äquilibriert. Nach Zugabe

des Kulturüberstandes wurden die Säulen zweimal mit 200 µl IMAC-Puffer gewaschen und

anschließend mit zweimal 100 µl Elutionspuffer (0,5 M Imidazol in IMAC-Puffer) in eine

neue Mikrotiterplatte eluiert. Die Minisäulen konnten durch die Zugabe von 250 µl

Regenerierungslösung (50 mM EDTA mit 1 M NaCl) regeneriert werden und standen für die

nächste Screeningrunde zu Verfügung.

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